免疫共沉淀实验指南

简介

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是一种基于抗原和抗体特异性结合的技术，用于研究蛋白质之间的相互作用。该方法常用于判断两种目标蛋白是否在体内结合形成复合物；也可用于确定一种特定蛋白质的潜在作用搭档。

原理

在非变性条件下裂解细胞时，细胞内蛋白间的相互作用可被保留。向细胞裂解液中加入针对蛋白M的抗体，孵育后再加入预处理的Protein A/G 琼脂糖凝胶。若细胞中存在与蛋白M结合的蛋白N，则可形成复合物：“蛋白N-蛋白M-抗蛋白M抗体-Protein A/G-琼脂糖凝胶”。通过对洗脱液进行SDS-PAGE、Western Blot或质谱分析，以验证两者间的相互作用。

步骤

1. 目标样本制备

1）血清及分泌表达目标蛋白样品处理

收集血清或培养基上清，检测目标蛋白浓度。若目标蛋白质浓度较高，建议用1×PBS稀释至蛋白质终浓度为10-100 μg/mL，以备后续实验。

2）细胞内表达目标蛋白样品处理

a. 将悬浮细胞或贴壁细胞从细胞培养瓶上吹下来后转入离心管中，1,000 rpm离心5min，弃上清。

b. 用预冷至4℃的1×PBS重悬细胞，1,000 rpm离心3 min，弃上清。重复1次。

c. 根据细胞的量加入相应体积的细胞裂解液，反复吹打后冰上放置10-20 min。

注：一般1 mL细胞裂解液可以处理约0.5-1×10⁷个细胞。为了避免目标蛋白质降解，可加入蛋白酶抑制剂（PMSF工作浓度：0.1-1.0 mmol/L）。

 d. 用超声破碎仪处理细胞裂解液，直至细胞裂解液透明，不再粘稠。冰上放置30 min后，12,000 rpm，4℃离心10 min。收集上清，可立即进行下一步实验或置于-80℃冻存。

注：若无超声破碎仪，也可使用削成斜口的枪头或注射器反复吹吸，直至细胞裂解液透明，不再粘稠。

2. 抗体-凝胶结合

1） ProteinA/G 凝胶准备：将凝胶充分混悬，取40 μL凝胶悬液（含 10 μL 凝胶，颗粒，其余为混悬液体），置于离心管中，加入250 μL 1×PBS，充分混悬，1,000 rpm，4℃ 离心30 s，弃上清；重复此洗涤步骤2 次。

2） 抗体准备：根据抗体说明书推荐的IP稀释比，用1×PBS稀释抗体，配制成抗体工作液。或将抗体总体积调整至500 μL。置于冰上备用。

3） 将稀释好的抗体加入预洗好的凝胶，轻柔混匀，在摇床上室温孵育30 min。

4） 1,000 rpm，4℃离心30 s，弃上清。

5） 加入250 μL 1 ×PBS，温和混匀，清洗凝胶，1,000 rpm，4℃ 离心30 s，弃上清。重复此步骤4次。得到抗体-凝胶复合物。

3. 目标蛋白与抗体-凝胶复合物结合

1）孵育：在抗体-凝胶复合物中加入200 μL准备好的样本，摇床上室温孵育30 min，也可4℃孵育2h或更长时间。

2）离心分离：孵育完毕后，1,000 rpm，4℃离心30 s，弃上清。加入250 μL 1×PBST，温和混匀，清洗凝胶，1,000 rpm，4℃ 离心30 s，弃上清。重复4次。

4. 洗脱及检测

以下两种目标蛋白洗脱方案，请根据后期检测的需要选择不同的目标蛋白洗脱方法。

1）变性洗脱法 （适用于SDS-PAGE 检测、Western Blot分析）

a. 向凝胶复合物加入2 μL 5×上样缓冲液，混合均匀，95℃煮样5 min。

b. 1,000 rpm，4℃ 离心30 s，收集上清液，根据实验需要，进行分析。

实验分组参考：

Input样品组：即总蛋白裂解液（未经免疫沉淀）

IgG对照组：使用同种属IgG代替一抗进行相同操作

实验组：即经1-3步骤处理得到的免疫沉淀后蛋白样品

2）酸性洗脱法（可用于后期功能分析）

a. 向凝胶中加入100-200 μl 酸性洗脱液，室温孵育10 min；

注：酸性环境会缩短免疫凝胶的使用寿命，应尽量缩短凝胶与酸性洗脱液的接触时间，建议不超过10 min。

b. 5,000 rpm，4℃ 离心30 s，收集上清至新的离心管，并立即滴入总体积 1/10 体积的10×PBS中和，将洗脱产物pH 调节至中性，样品可用于后期功能分析（如质谱分析）。

实验分组参考：

IgG对照组：使用同种属IgG代替一抗进行相同操作

实验组：即经1-3步骤处理得到的免疫沉淀后蛋白样品