细胞功能 | 原位荧光法TUNEL结果异常？这些细节你忽略了！
Source: Elabscience®Published: 2024-12-16
细胞凋亡是一种受到基因严格调控的程序性细胞死亡方式，表现为一种高度规范化、有序和无炎症响应的过程，对于身体和器官的正常发育、免疫系统功能发挥以及防止异常细胞增殖和癌症的发生具有重要作用。原位荧光法TUNEL是一种用于检测细胞凋亡的实验技术。很多同学在做原位TUNEL会遇到一些异常结果，例如：全阳性、阳性信号弱、背景荧光亮、非特异性染色多、染色不均匀等，今天Elabscience就为大家集中讲解一下出现这些异常的解决方案。
原位TUNEL实验原理
细胞在凋亡过程中会表现出一系列独特的现象，其中DNA链均匀断裂为180-200bp的片段并暴露出大量3’-OH黏性末端是凋亡晚期的特征性指征之一。TUNEL实验法在TdT酶的作用下将荧光标记的dUTP连接到由于DNA片段化而暴露出的黏性末端上，在荧光显微镜下观察时，可以清晰分辨出处于凋亡晚期的细胞。
原位TUNEL实验操作步骤
原位TUNEL实验分组设置
分组 | DNA酶 | TdT酶 | 荧光染料 | 目的 |
阴性对照 | × | × | √ | 排除非特异性染色，调节拍照设置 |
阳性对照 | √ | √ | √ | 验证试剂和操作 |
实验组 | × | √ | √ | 检测各样本凋亡比例 |
原位TUNEL实验异常结果分析
全阳性结果
可能原因 | 解决方案 |
用DNA酶处理了样本 | 重新进行实验，注意只有阳性对照需要只用DNA酶处理 |
曝光过强 | 降低曝光时间，可使用阴性对照辅助进行曝光条件设置 |
细胞涂片干片过度 | 不要加热烘干涂片，在4℃条件下晾干 |
高温处理 | 不要将该样本同时用于TUNEL实验和需要进行高温抗原修复的免疫荧光实 |
阳性信号弱
可能原因 | 解决方案 |
试剂失效 | 更换新的染色试剂或辅助试剂（如洗涤buffer等） |
试剂配制不完全 | 确认器材状况，确保所有试剂完整配制和加入 |
凋亡诱导不充分 | 优化凋亡诱导方案 |
荧光素猝灭 | 染色过程中注意避光，染色完成后尽量避光并及时检测，拍照过程中减少光照时间 |
固定剂选用不当 | 尽量使用多聚甲醛或福尔马林替代甲醇或乙醇进行固定 |
通透不充分 | 适当延长通透时间 |
背景荧光亮
可能原因 | 解决方案 |
染色时间过长 | 控制染色时长，通常在60分钟左右 |
漂洗不足 | 增加染色后漂洗次数 |
操作过程中干片 | 在操作过程中保持样本处于湿润状态，中途暂停是可使用PBS覆盖或浸没样本 |
脱蜡不充分 | 低温时延长脱蜡时间或更换新的二甲苯溶剂 |
曝光时间过长 | 提高分辨率，调节黑平衡或降低曝光时间 |
非特异性染色多
可能原因 | 解决方案 |
血液残留 | 制备切片前对组织进行充分灌注 |
样本中有杂质 | 制备切片前充分清洗组织样本 |
平衡不完全 | 增加平衡液孵育时间，增加洗涤次数，提高拍照分辨率 |
染色不均匀
可能原因 | 解决方案 |
脱蜡不充分 | 低温时延长脱蜡时间或更换新的二甲苯溶剂 |
通透剂不合适 | 使用合适的通透剂处理样本，通常选用蛋白酶K处理石蜡切片和冰冻切片，使用Triton X-100处理细胞爬片和细胞涂片 |
以上就是原位荧光法TUNEL常见的异常结果分析，如果您还遇到了其他的问题，欢迎评论区留言！更多细胞功能检测干货，请持续关注Elabscience®~
