ELISA | 超详实的ELISA实验样本处理操作指南

在ELISA实验中，样本处理是决定实验成败的关键环节。无论是血清、血浆、细胞培养上清，还是细胞裂解液、组织匀浆，甚至尿液、唾液等生物样本，不同类型的样本都需根据其特性进行规范的预处理。科学的样本处理不仅能最大限度地保留目标蛋白的活性，还能有效减少杂质干扰，为后续检测提供可靠的基础。接下来，Elabscience将为您详细解析几种常见样本的处理方法，助力您的实验精准高效。

一、常规样本处理方式

1、血清

使用不含抗凝剂的采血管收集血液样本，将样品于室温下放置1 h或2-8°C过夜后，于2-8°C，1000×g离心20 min，取上清，即可检测。

2、血浆
使用含抗凝剂的采血管收集血液样本，抗凝剂推荐使用EDTA-Na2，样品采集后30 min内，于2-8°C，1000×g离心15 min，取上清，即可检测。

3、细胞培养上清
将细胞培养上清液吸入离心管中，在2-8°C条件下，以1000×g离心20 min，除去细胞碎片和杂质，取上清，即可检测。

4、细胞裂解液

① 用冷的PBS轻轻清洗贴壁细胞，使用胰蛋白酶消化，1000×g离心5 min后收集细胞；悬浮细胞可直接离心收集；

② 将收集到的细胞用冷的PBS洗涤3次。每106个细胞中，加入150-200 μL PBS重悬（推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂；若含量很低，可减少PBS的体积），并通过反复冻融或超声使细胞破碎；

将提取液于2-8°C，1500×g离心10 min，取上清检测。

5、组织匀浆

(1) 用预冷的PBS（0.01 M，PH 7.4）冲洗组织，除去表面残留的血液或杂质；

(2)  将组织块称重，再切成尽可能小的碎块，以便充分匀浆；

(3)  加入适量的预冷PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g组织样品对应9 mL PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂），用玻璃匀浆器在冰上或冰浴中充分匀浆。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融；

(4)  将匀浆液吸入离心管中，2-8°C条件下，以5000×g离心5-10 min，取上清检测。

二、特殊样本处理方式

6、脑脊液

人脑脊液的采集：

一般由专业医师在患者腰椎的4-5间隙穿刺或枕骨下鞘穿刺，以获取脑脊液。

动物脑脊液采集部位会根据具体实验要求和动物类型而有所不同。常见的动物脑脊液采集部位包括颅内、颈部或腰椎部位。

动物脑脊液的采集（以大鼠为例）：

① 动物麻醉后，头部固定于定向仪上。用湿纱布擦拭大鼠颈背部皮肤，剪去背毛暴露皮肤。两耳连线剪一横切口（1.5 cm左右），在其中点向尾侧沿皮下剪开2 cm，将皮分离两侧，扩大视野；

② 紧贴大鼠头骨依次逐层剪切各肌层，并断端依次拉向尾侧扩大视野；

注意：有出血时用干纱布按压止血，保持术口清晰。

③ 接近颈后黄韧带时，小心地用7号注射针头分离覆盖的肌肉，暴露寰枕膜；

④ 用1 mL注射器（针头用止血钳使针尖与针体成150度钝角），针斜面向上，针尖端近水平刺入蛛网膜下腔，固定针体，缓慢抽取脑脊液，一般采集量为100-200 μL；

⑤ 用无菌管收集脑脊液样本，在2-8°C条件下，以1000×g离心20 min，除去杂质，取上清，即可检测。

7、肺泡灌洗液

人肺泡灌洗液的采集：

患者接受局部麻醉后，经气管插管插入支气管镜冲洗肺部，用生理盐水冲洗并回收液体，被收集的液体即为肺泡灌洗液。

动物肺泡灌洗液的采集（以小鼠为例）：

① 准备肺泡灌洗液装置（灌胃针连接静脉留置针）和预冷的PBS（含1% FBS）；

② 用1 mL注射器肺泡灌洗液装置，吸取冷的PBS并排尽气泡，置于冰上备用；

③ 抓取小鼠，眼球放血，脱臼处死（不要伤及气管），待小鼠彻底死亡后，用酒精浸湿小鼠皮毛；

④ 将小鼠平躺在泡沫板上，固定小鼠四肢，剪开颈部皮肤，剥离组织和肌肉，分离气管，用眼科剪在小鼠气管（靠近头部）开小口；

⑤ 将静脉留置针小心从小口插入气管，将1 mL注射器连接于静脉留置针；

⑥ 缓慢推注500 μL预冷PBS，轻轻揉动小鼠胸部15-20 s，边节律性按压胸部，边抽注射器（抽取刻度至700-800 μL），第一次灌洗一般能收取300 μL灌洗液；

⑦ 重复步骤⑥，此次一般可获取500 μL灌洗液，收集于EP管中；

⑧ 用无菌管收集肺泡灌洗液样本，在2-8°C条件下，以1000×g离心20 min，除去杂质，取上清，即可检测。

8、尿液

使用无菌容器收集尿液样本，在2-8°C条件下，以1000×g离心20 min，除去杂质，取上清，即可检测。

9 、唾液

使用无菌EP管收集唾液后，在2-8°C条件下，以4000×g离心10 min，除去杂质，取上清，即可检测。建议使用新鲜的唾液样本。

10 、乳汁

使用无菌容器收集乳汁样本，在2-8°C条件下，以1000×g离心15 min，取澄清部分，再重复此过程2次，取澄清液，即可检测。

11、粪便

使用无菌容器收集粪便样本，以9 mL/g的比例，向粪便中添加PBS缓冲液（0.01 M，pH 7.4；可选择性添加0.05 M EDTA），置于冰上振荡15 min。在2-8°C条件下，5000×g离心5-10 min，取上清，即可检测。

12、其他生物体液

收集液体后，于2-8°C，1000×g离心20 min，除去杂质及细胞碎片，取上清检测。

三、样本注意事项

1、样本收集

采集血液样本时，应尽可能避免溶血现象，同时也应避免细菌污染，以免造成假阳性结果。

避免使用高血脂样本。脂质会影响样本的均一性，且会影响抗原抗体的结合，从而导致测值准确性的降低。

2、样本保存

样品收集处理后，若在1周内进行检测，可保存于2-8°C环境中；若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20°C（1个月内检测）或-80°C（3个月内检测）环境中，避免反复冻融。实验前，建议再次离心，除去沉淀物。

3、样本稀释

试剂盒的检测范围不等同于样本的浓度范围。如果样本中待测物的浓度高于标准品的最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释（建议查阅文献，并做预实验）。

4、样本成分

处理细胞提取液或组织样本时，不建议使用商品化的裂解试剂。裂解试剂中的部分成分，可能会破坏蛋白的空间构象，影响抗原抗体的结合，或造成基质干扰，最终影响实验结果。

样本处理是ELISA实验成功的关键。规范操作、选择优质试剂盒，并遵循样本保存和稀释建议，将有效提升实验数据的准确性和可靠性。