免疫细胞 | T细胞分选大揭秘：荧光激活细胞分选与磁激活细胞分选

在免疫学的世界中，T细胞扮演着关键角色，它们通过多样的亚群和功能，守护着我们的健康。精确研究T细胞，需要依赖精细的分选技术，荧光激活细胞分选与磁激活细胞分选为科研人员提供了强大的工具。我们将和大家一起探讨这两种技术在T细胞分选中的应用。

一、 T细胞简介

T细胞是一类包含多种细胞亚群、具有多种生物学功能的淋巴细胞。根据细胞表面T细胞受体（TCR）组成的不同，T细胞可分为αβ Τ细胞和γδ Τ细胞。同时αβ Τ细胞和γδ Τ细胞也可根据细胞标志物及功能的不同被进一步划分为其他亚群。如根据是否表达CD4和CD8分子，αβ Τ细胞可分为CD4 T细胞和CD8 T细胞；根据细胞功能的不同，CD4 T细胞能够分为对免疫反应具有促进作用的辅助T细胞（Th细胞）、对免疫反应具有抑制作用的调节性T细胞（Treg细胞）。Th细胞还可因为辅助免疫反应类型的不同进一步划分为Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞以及Tfh细胞。因此对高度异质性的T细胞进行研究和应用就需要精细的鉴定手段（如流式细胞术）和细胞分选手段（如荧光激活细胞分选与磁激活细胞分选）以排除其他免疫细胞甚至是其他T细胞亚群对结果的影响。

图1. CD4效应 T细胞亚群及其功能（Janeways Immunology 9e）

一、 常见的细胞分选方法

细胞分选技术是指从异质细胞混合物中（常见为组织细胞悬液、血液样本等）分选特定的一种或多种目的细胞的技术。常见细胞分选技术主要可分为两类：基于细胞物理性质的分选技术、基于生化亲合力的分选技术。

1.基于细胞物理性质的分选技术

基于细胞物理性质的分选技术包括密度梯度离心、沉降法、粘附法等。

•  密度梯度离心利用不同密度细胞在离心过程中居留在密度梯度离心液等密度点的特性分离细胞，因此可用于从外周血中分离单个核细胞（PBMC）或去除死细胞；

•  沉降法利用不同组分的沉降速率不同分离细胞，该方法可用于分离红细胞和白细胞；

•  粘附法通过将异质细胞混合物在合适的条件下进行培养，从而实现贴壁细胞和悬浮细胞的分离，如通过培养诱导单核细胞分化能够分离贴壁的巨噬细胞。

基于细胞物理性质的分选技术虽然操作简便，但分选细胞纯度低，无法分选更为细分的细胞群体，因此不适用于T细胞的分选。

2.基于生化亲合力的分选技术

基于生化亲合力的分选技术包括荧光激活细胞分选（流式分选，FACS)和磁激活细胞分选（磁珠分选，MACS）。这两种细胞分选方法各有优劣，但都可达到分选细胞纯度高、分选细分的细胞亚群的要求，因此是目前使用最为广泛的两种细胞分选技术。T细胞的分选也基本采用磁激活细胞分选和荧光激活细胞分选。

二、 荧光激活细胞分选

荧光激活细胞分选是在流式细胞术基础上发展而来的。实验开始前，需制备单细胞悬液，并通过荧光探针标记（流式抗体标记）细胞。使用分选型流式细胞仪（如BD Aria Ⅲ）对样本进行分析与分选。包裹有目的细胞的液滴将被带上正电荷或负电荷，通过带有高压的偏转板时，在高压电场的作用下将发生不同的偏转，落入各自的收集容器中；而包裹非目的细胞的液滴没有电荷标记，落入中间的废液收集器，从而实现目的细胞与非目的细胞的分离。

图2. 荧光激活细胞分选的原理

从荧光激活细胞分选的原理及实验流程不难看出，该方法具有如下优点：

①　可分选细分的细胞亚群。当前很多分选型流式细胞仪都可实现十多至二十多探针检测，因此可以实现极其细分细胞亚群的分选；

②　可实现单细胞水平的分选；

③　可在同一样本中同时分选多种目的细胞；

④　可基于细胞内标志物进行细胞分选，也可基于标志物表达水平不同进行细胞分选；

⑤　目的细胞纯度高，回收率高。

但荧光激活细胞分选的缺点也较为明显，包括：

①　细胞经历高压电场，细胞活性受到不利影响。同时若分选样本中包含有害物质，高压电离产生的气溶胶会对实验者健康产生不利影响；

②　每次仅可实现一个样本的分选，分选通量低；

③　分选大体积样本时，实验耗时可能需要数小时；

④　分选型流式细胞仪价格昂贵；

⑤　实验者需具有流式细胞术基础，对实验者的技术及操作要求高。

一、 磁激活细胞分选

磁激活细胞分选利用抗体或配体以及磁性微球（磁珠）标记细胞。当标记后样本置于磁场中时，磁珠因磁力作用携带标记细胞沉淀在磁极处，而未标记细胞停留在上清中，从而实现标记细胞与未标记细胞的分离。根据标记细胞是否为目的细胞，磁激活细胞分选可分为阳性分选（正选）与阴性分选（负选）（点击回顾）。

图3. CD4 T细胞阴性磁激活细胞分选原理

与荧光激活细胞分选相比，磁激活细胞分选具有以下优点：

①　细胞仅经历低强度磁场，细胞活性更有保证；

②　可同时分选多个样本，分选通量高；

③　分选样本体积大，根据分选磁力架的不同，可分选5 mL、15 mL、50 mL样本，实验耗时多在30 min内；

④　相较于分选型流式细胞仪，细胞分选磁力架价格极低；

⑤　实验操作流程简便，对实验者技术要求较低。

但其缺点也较为明显，包括:

①　分选细胞细分程度不如荧光激活细胞分选；

②　不可实现单细胞水平的分选；

③　仅可在同一样本中同时分选一种目的细胞；

④　不可基于细胞内标志物进行细胞分选，不可基于标志物表达水平不同进行细胞分选；

一、 联合使用荧光激活细胞分选和磁激活细胞分选分离T细胞

荧光激活细胞分选和磁激活细胞分选的优缺点在很大程度上是互补的，当单一分选方法无法满足实验所需时，可联合使用两者。比如需要分选γδ Τ细胞中的某一或某几个细胞亚群时，由于γδ Τ细胞占比较低，单纯使用荧光激活细胞分选，实验耗时长。而使用磁激活细胞分选可能由于细胞细分程度高，无法使用合适的分选标志物进行区分。此时可首先使用γδ Τ细胞磁性分选试剂盒对样本中的γδ Τ细胞进行富集，随后对富集细胞进行荧光激活细胞分选。这样既可减少实验时长，也可得到高纯度的目的细胞。

以上就是本期T细胞分选策略：荧光激活细胞分选与磁激活细胞分选的所有内容了，通过不断优化和创新这些技术，我们可以更深入地探索T细胞的奥秘。如有相关问题，欢迎在线留言！