WB条带出现各种状况? 原因分析和解决方法在这里！
Source: Elabscience®Published: 2019-09-19
Western Blot虽是实验室最常用的蛋白分析技术，但是由于它步骤繁琐、操作流程长、影响因素多，所以，导致我们在做实验时会遇到各式各样的问题。今天我们总结了一些WB实验中经常遇到的各种“奇葩”条带问题，并为你推荐了常用的解决方法，希望对大家有所帮助。
一、 目标条带没有信号
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原因分析 |
解决方法 |
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样品中可能含有蛋白酶，使蛋白样品分解成小分子。 |
添加蛋白酶抑制剂。 |
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目标蛋白浓度过低（低于检测下线）。 |
加大上样量或提高目标蛋白浓度。 |
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转膜时间太短导致目标蛋白没有充分转移到膜上，或者转膜时间过长导致样品转穿。 |
控制转膜时间并选择适合的转印膜。 |
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一抗的特异性不佳，导致一抗无法识别目标蛋白。 |
选用高品质抗体。 |
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一抗反复使用后导致效价降低，尽管还能与目标蛋白连接，但连接蛋白的数量太少。 |
一抗不宜反复使用。 |
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洗脱过渡导致与一抗相结合的目标蛋白被洗掉。 |
洗脱时间的时间和频率应有效控制，一般建议3次10分钟。 |
二. 图片背景过高，难以分辨条带
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原因分析 |
解决方法 |
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一抗浓度太高，导致抗体非特异性结合。 |
降低一抗浓度。 |
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洗膜的时间和次数不够，导致其他蛋白没有清洗干净。 |
提高洗脱时间和频率。 |
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封闭物用量不足。 |
提高封闭物浓度，孵育时保证封闭液完全浸没转印膜。 |
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封闭物使用不当。 |
检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭。 |
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封闭时间不够。 |
室温37度封闭1小时以上，4度封闭过夜。 |
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一抗稀释度不适宜。 |
对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。 |
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一抗孵育的温度偏高。 |
建议4℃结合过夜。 |
三、 膜上出现黑点和黑斑
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原因分析 |
解决方法 |
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膜上其他部位与一抗或二抗非特异性结合，配置的封闭液可能没有完全溶解，使不容颗粒附着在膜上从而导致发光时候膜上形成黑点。 |
配置封闭液后最好静止一下，封闭牛奶一定要纯，封闭结束之前要清洗三遍之后再加一抗。 |
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抗体与封闭试剂反应。 |
使用前过滤封闭试剂。 |
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HRP 偶联二抗中有聚集体。 |
过滤二抗试剂，去除聚集体。 |
四、 出现非特异性条带
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原因分析 |
解决方法 |
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一抗非特异性与蛋白结合，此种情况大多数情况是因为一抗特异性不好。 |
更换一抗。 |
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目的蛋白有多个修饰位点，有些一抗还能结合其他蛋白的结合位点。 |
更换一抗品种。 |
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蛋白样品降解，蛋白酶将目标蛋白分解成若干个蛋白，而这些蛋白同样可以被一抗识别。 |
添加蛋白酶抑制剂。 |
五、条带中出现整条白色空斑
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原因分析 |
解决方法 |
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过高的蛋白上样量或一抗和二抗浓度过高都会促使底物过快的消耗，导致我们在做化学发光检测时，发光底物已经消耗殆尽而形成空斑。 |
减少蛋白上样量、稀释一抗和二抗的浓度。 |
六、条带中出现白圈
| 原因分析 | 解决方法 |
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转膜时候，膜与胶之间有气泡。转膜时候，膜与胶之间有气泡。转膜时候，膜与胶之间有气泡。转膜时候，膜与胶之间有气泡。转膜时候，膜与胶之间有气泡。转膜时候，膜与胶之间有气泡。转膜时候，膜与胶之间有气泡。转膜时候，膜与胶之间有气泡。转膜时候，膜与胶之间有气泡。 |
制作“三明治”时，注意赶走气泡。通常将电转液倒入一个盘子里，液体高度与第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇一些转膜液，把电泳胶用清水清洗后平铺在滤纸上，随后在确认滤纸与胶之间无气泡后，再往胶上浇一些电转液，之后用双手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜两侧中间，使膜成U型，再将U型底部接触到胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样可以减少气泡。上层滤纸同样用U型的放置方法，可以用玻璃棒贴实一下，然后盖上海绵垫。 |
七、 条带拖尾
| 原因分析 | 解决方法 |
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这种情况很容易出现，因为导致条带拖尾的原因很多，可能性较大的是一抗浓度太高，作用时间太长或蛋白量过大。 |
根据情况调整蛋白量，同时降低一抗的浓度，缩短一抗的时间。 |
八、条带变形
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原因分析 |
解决方法 |
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胶体中存在气泡，或不溶性杂质，胶不均不平整。 |
配胶时用的小烧杯，水，SDS，tris等等干净无杂质。贴边角加入液体，凝固时避免大幅度动作触碰。 |
九、条带呈哑铃装
| 原因分析 | 解决方法 |
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出现哑铃装条带的问题，最大的可能性就是胶没有配置好，胶凝固后不均一。另外还有一种可能就是样品中含有太多杂质，没有离心下来，然后杂质沉淀在孔的中间，蛋白被挤到两边。 |
把胶配好，不合格的胶坚决不能用。 |
十、最边缘条带弯曲
| 原因分析 | 解决方法 |
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电泳电流不均一。 |
换电泳槽，或者不使用两边的孔。 |
十一、背景非均一性
| 原因分析 | 解决方法 |
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膜可能干过。 膜可能干过。 膜可能干过。 膜可能干过。 膜可能干过。 膜可能干过。 膜可能干过。 膜可能干过。 |
在每一步的操作过程中，都需要注意不要让膜干掉，确保蛋白面不要被风干很长时间，一定要用不漏水的封闭盒并盖上盖子，防止过夜16个小时液体流失。 |
十二、 条带呈“微笑”或“倒微笑”状
| 原因分析 | 解决方法 |
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条带呈“微笑U”状，凝胶冷却不均一，电泳槽老化。 |
更换电泳槽。 |
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条带呈“倒微笑∩”装，凝胶左右两头没有凝固好。 |
重新制胶。 |
十三、其他问题
| 原因分析 | 解决方法 |
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蛋白分子量偏高或者偏低。 |
可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应，比如说100KD的蛋白你用12%的胶跑，或者说20KD的蛋白你用6%的胶跑。 |
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蛋白质降解。 |
蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。 |
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所有条带连成一片没有间隔。 |
原因最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。 |
以上是我们对WB条带出现各种状况及解决方法的一个总结，希望可以对大家有所帮助。如果各种原因都试变了，还是做不好WB实验怎么办？
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