ELISA | ELISA实验基础：新手也能轻松上手的专业指南
Source: Elabscience®Published: 2025-02-11
ELISA，即酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），自1971年由Engvall等人首创以来，已逐渐成为目前生物科学研究中一种不可或缺的工具。基于免疫组化中的酶免疫分析方法，ELISA采用固相免疫测定的形式，有效地探测到体液中微量且关键的生物标志物。继免疫荧光和放射免疫技术之后，ELISA以其独特的优势迅速崛起，在临床检验领域占据了重要地位，成为生物学和医学科学研究中的重要工具。
现在，让我们一同深入了解ELISA的基本原理及其分类，探讨直接法、间接法、夹心法和竞争法这四种主要方法之间的区别与优劣势，为那些对ELISA实验尚存疑惑的同学们拨开迷雾，揭示其中的奥秘。
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ELISA基本原理
ELISA是一种基于免疫反应的高灵敏度实验技术，其基本原理是：利用抗原抗体的特异性反应，结合酶对底物的高效催化作用，来检测靶蛋白的含量。
实验时，需要将抗原或捕获抗体包被于固相载体上，通过检测分子（酶或荧光基团），将化学信号转换为电信号，以OD值或发光值的结果，对靶蛋白进行定量分析。
图1. ELISA基本原理（以双抗体夹心法为例）
ELISA的分类
ELISA可同时用于测定抗原和抗体。根据ELISA实验原理及操作的不同，可以将ELISA大致分为四类：直接法、间接法、夹心法和竞争法。
图2. ELISA分类
01 直接法（Direct ELISA）
直接法将抗原或抗体固定到酶标板上，用带有酶标记的一级抗体或一级抗原，与之特异性结合，再利用酶催化底物显色，即可测定总靶标蛋白的含量。
02 间接法（Indirect ELISA）
间接法常用于检测抗体。将抗原固定到酶标板上，加入一抗，与抗原特异性结合，再加入带有酶标记的二抗，使二抗与一抗特异性结合，最后加入底物，使底物与酶反应显色，即可测定总靶标蛋白的含量。
03 夹心法（Sandwich ELISA）
夹心法分为双抗体夹心法和双抗原夹心法，适用于检测具有多个识别位点的大分子蛋白等。
双抗体夹心法ELISA：此方法常用于检测抗原。将抗体固定在固相载体上，加入待测抗原，与抗体特异性结合，再加入酶标抗体检测，并利用底物显色，即可测定总靶标蛋白的含量。
双抗原夹心法ELISA：反应模式与双抗体夹心法类似，用固相抗原和酶标特异性抗原，分别代替固相抗体和酶标特异性抗体，即可测定样品中的抗体。
夹心法ELISA的显色结果与待检抗原（或抗体）的量成正比。
04 竞争法（Competitive ELISA）
竞争法适用于测定只有一个识别位点的小分子物质。其原理是：标本中的抗原及一定量的酶标抗原，竞争性地与固相抗体相结合。标本中的抗原含量越多，结合在固相上的酶标抗原就越少，最终显色也越浅。需要注意的是，显色结果与待检抗原（或抗体）的量成反比。
4种ELISA方法的比较
方法分类 | 间接法 | 直接法 | 夹心法 | 竞争法 |
适用性 | 在临床诊断中是检测标志性抗体的重要手段。 | 在实际中运用较少，只能测定酶标记的分子。 | 适用于检测具有多个识别位点的大分子蛋白等。 | 适用于小分子抗原，如激素和药物类的测定。 |
优势 | ① 不加酶标记的一级抗体能保留更多的免疫反应性，具有更高的灵敏度； ② 需要更少的标记抗体（二抗一般为多抗，可标记多个酶分子），更经济。 | ① 实验步骤少，检测速度快； ② 不需要用到二抗，避免了交叉反应，测定结果不容易出错。 | 高灵敏、高特异性，抗原无须事先纯化。 | 可适用于比较不纯的样本，数据再现性高。 |
劣势 | ① 发生交叉反应的机率较高（酶标二抗直接与抗原结合）； ② 实验中多了二抗孵育的步骤，实验周期延长。 | ① 由于抗原不是特异性固定，实验背景会比较高，灵敏度低； ② 检测对象有限，只能测定酶标记的分子。 | ① 抗原一定要拥有两个以上的抗体结合部位； ② 对配对抗体要求高，事先应优化降低捕获抗体与检测抗体之间的交叉反应性。 | 整体的敏感性和特异性都较差。 |
了解ELISA基本原理、分类及不同方法的特点，有助于我们根据实际需求选择最合适的检测方案，从而提高实验的准确性和效率。更多ELISA实验干货，请持续关注Elabscience®~
