ELISA | 探索免疫世界的窗口——ELISpot技术详解
Source: Elabscience®Published: 2025-02-25
随着生物医学领域的发展，对于免疫系统功能的深入理解和精准测量变得越来越重要。酶联免疫斑点技术（ELISpot）作为一种高效技术手段，在这一过程中扮演了关键角色。通过ELISpot，研究人员能够准确地定量分析单一免疫细胞分泌的细胞因子或其他分子，为免疫应答研究提供新的研究思路。
本期推文，Elabscience将带领大家走进ELISpot的世界，让我们一起揭开免疫反应背后的秘密吧！
01 ELISpot技术简介
酶联免疫斑点技术（Enzyme Linked ImmunoSpot Assay，ELISpot）是一种基于ELISA原理进行创新的细胞检测技术。ELISpot技术的历史可以追溯到1978年，当时牛津大学的Don Mason教授开发了一种“胶片上的斑点技术”，这种方法是用于检测抗体分泌细胞的早期尝试。而后，ELISpot在1983年由J.D. Sedgwick和C. Czerkinsky两位科学家分别独立发展起来，他们引入了酶联免疫的概念，并将其应用于斑点形成的技术中，使得这种技术更加实用，灵敏度更高[1, 2]。
ELISpot可检测单个细胞分泌细胞因子/抗体的能力，对样本中活细胞免疫状态进行动态监测评估。如图1所示，将细胞培养在包被了特异性捕获抗体的PVDF板中，细胞分泌的靶标蛋白被特异性包被抗体捕获，孵育适当时间后，去除细胞并加入生物素化抗体，通过酶促显色反应形成沉淀物，即“Spot”——“斑点”[3, 4]。
ELISpot具备高灵敏度、高通量筛选、活细胞功能评价、操作简单等技术优点，被广泛应用于疫苗研究、药物筛选、感染性疾病诊断与研究[5]、肿瘤免疫研究[6]、自身免疫病研究、过敏研究、移植中排斥反应的预测等多个免疫相关研究中。
图1. ELISpot原理图（图源网络，侵删）
02 ELISpot技术进阶版——FluoroSpot
FluoroSpot是在ELISpot的基础上发展的新技术，用荧光检测代替了比色法，将不同波长的荧光团混合在一起，通过滤光片即可实现多种细胞因子的精确检测[7]，既保留了ELISpot高灵敏度的特点，又可同时分析分泌不同细胞因子的多个细胞群体。以三色FluoroSpot为例[8]，96孔板的PVDF膜上同时包被IFN-γ、IL-17A、IL-22因子的捕获抗体，用不同发射波长的荧光素标记，生成不同颜色的荧光斑点可以通过FluoroSpot分析仪对三种因子分别进行斑点计数和数据分析。
图2. 三色FluoroSpot IFN-γ/IL-17A/IL-22荧光斑点试验示意图[8]
03 ELISpot与ELISA对比
从技术本质上，ELISpot和ELISA都是基于双抗夹心法原理，但ELISA是对检测样本溶液中靶标蛋白浓度的定量测定，而ELISpot是对样本中活细胞免疫状态进行动态的检测评估。详细对比如下
表1. ELISpot与ELISA的区别
区别 | ELISpot | ELISA |
原理/方法 | 双抗夹心法原理 | 直接法/间接法/双抗夹心法/竞争法等 |
检测目标 | 实时分泌细胞因子或抗体的细胞频率 | 样本中已存在的靶标蛋白含量 |
样品类型 | PBMC、脾脏细胞、其他细胞 | 细胞上清、细胞/组织裂解液、血清血浆，其他尿液、唾液、乳汁等分泌液 |
样品板 | 孔板底部需覆有PVDF膜 | 普通酶标孔板 |
灵敏度 | 较高，可精确到检测出几十万甚至百万个淋巴细胞中的一个活化细胞的细胞因子分泌 | 比ELISpot低2-3个数量级 |
检测设备 | ELISpot Reader | Microplate Reader |
酶促反应 | 1、基于ALP的BCIP/NBT着色 2、基于HRP的AEC或沉淀型TMB着色 | 1、基于HRP的TMB、OPD或ABTS显色 2、基于ALP的pNPP显色 |
检测结果 | 半定量 | 定性、定量、半定量 |
检测方式 | 通过显色反应，在分泌细胞因子的位置显现清晰斑点，每个班点代表一个细胞，从而计算出分泌该细胞因子的细胞的频率 | 通过显色反应，测吸光度，与标准曲线比较计算出可溶性蛋白总量 |
以上就是ELISpot的详细介绍，相信大家对ELISpot有了更加全面的认识。从其基本原理到实际应用，ELISpot以其独特的优势，在疫苗开发、肿瘤免疫治疗等多个方面展现出了巨大的潜力。随着科学技术的不断进步，相信ELISpot还将为人类健康事业做出更大贡献。
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参考文献：
[1] P.G.H. J D Sedgwick, A solid-phase immunoenzymatic technique for the enumeration of specific antibody-secreting cells, J Immunol Methods 57(1-3) (1983) 301-9.
[2] L.A.N. C C Czerkinsky, H Nygren, O Ouchterlony, A Tarkowski, A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells, J Immunol Methods 65 (1983) 109-121.
[3] M. Faresjo, Enzyme linked immuno-spot; a useful tool in the search for elusive immune markers in common pediatric immunological diseases, Cells 1(2) (2012) 141-52.
[4] E. Girmanova, P. Hruba, O. Viklicky, A. Slavcev, ELISpot assay and prediction of organ transplant rejection, Int J Immunogenet 49(1) (2022) 39-45.
[5] C. Tincati, A.J. Cappione Iii, J.E. Snyder-Cappione, Distinguishing Latent from Active Mycobacterium tuberculosis Infection Using Elispot Assays: Looking Beyond Interferon-gamma, Cells 1(2) (2012) 89-99.
[6] A.M. Malyguine, S. Strobl, K. Dunham, M.R. Shurin, T.J. Sayers, ELISPOT Assay for Monitoring Cytotoxic T Lymphocytes (CTL) Activity in Cancer Vaccine Clinical Trials, Cells 1(2) (2012) 111-26.
[7] S. Janetzki, Immune monitoring technology primer: the enzyme-linked immunospot (Elispot) and Fluorospot assay, J Immunother Cancer 3 (2015) 30.
[8] T. Dillenbeck, E. Gelius, J. Fohlstedt, N. Ahlborg, Triple Cytokine FluoroSpot Analysis of Human Antigen-Specific IFN-gamma, IL-17A and IL-22 Responses, Cells 3(4) (2014) 1116-30.
