流式课堂 | 流式实验的那些坑，一文教你全搞定
Source: Elabscience®Published: 2025-01-13
流式细胞术是利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术，具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大、分析全面、分选纯度高、方法灵活等特点。Elabscience老师总结了流式实验常见的三大问题，看完可以帮助大家有效避坑！
检测结果无信号或信号弱
可能原因 | 解决方案 |
抗体贮存不当 | 抗体应保存在2-8℃中，避光保存，同时避免反复冻融 |
抗体过期 | 使用处于保质期内的抗体 |
过度固定 | 尽量选择新鲜样本检测，可通过预实验确定适合样本的固定剂和固定条件 |
荧光染料淬灭 | 荧光抗体和荧光抗体染色后的样本都应该避光保存，染色完成后尽快上机 |
自发荧光较高 | 用空白对照确定自发荧光水平；基于“荧光素强度”、“相互干扰程度”等配色原则选择合适的流式抗体 |
染色时间和温度不当 | 抗体染色条件可参考说明书，可根据实验情况适当调整。一些克隆号在较高温度下或较长染色时间下的染色效果较好 |
抗体浓度过低 | 滴定抗体以确定最佳浓度 |
细胞数量过多 | 调整细胞密度，确保细胞数量适中，通常应低于1×107个/ml |
荧光素不稳定 | 根据荧光素的特性，选择合适的保存条件、孵育条件和配色方案 |
靶抗原含量低/不存在 | 确认靶蛋白在检测样本中正常表达；可以先进行细胞富集再检测 |
抗体无法结合胞内抗原 | 优化固定破膜方法；选择小分子荧光素检测抗原；使用阻断剂防止细胞因子分泌至胞外 |
补偿调节过度 | 尽量选择发射光谱不重叠的染料；检查补偿设置，确保每种荧光染料的信号正确补偿 |
细胞群的设门不正确 | 确保对细胞群的正确设门，使用死活染料并对单细胞群设门，可大幅度减少假阳性 |
使用的滤光片不正确 | 检查所用荧光染料的激发波长与发射波长，确保使用正确的激光器和滤光片 |
仪器无法检测该荧光素 | 更换其他合适的荧光抗体或者更换合适的流式细胞仪检测 |
信号获取速度太快 | 调整细胞密度；降低仪器吸取细胞的速度 |
增益太低/阈值太高 | 使用空白管调节参数；增加增益以提高信号强度；调整阈值以保证荧光信号不被切掉 |
仪器故障 | 定期对仪器进行质检 |
荧光强度过高
可能原因 | 解决方案 |
染色时间太长 | 抗体染色条件可参考说明书，可根据实验情况适当调整 |
抗体浓度过高 | 滴定抗体以确定最佳浓度 |
补偿不当 | 尽量选择发射光谱不重叠的染料；检查补偿设置，确保每种荧光染料的信号正确补偿 |
洗涤不充分 | 优化洗涤步骤，适当增加洗涤次数 |
高表达抗原搭配荧光亮度高的荧光素 | 基于“强表达抗原搭配弱荧光染料”等配色原则选择合适的流式抗体 |
仪器参数设置不合理 | 检查流式细胞仪的激光强度和增益设置，调整为合适水平以避免过度饱和 |
背景高
可能原因 | 解决方案 |
死细胞、粘连体非特异性结合 | 使用新鲜样本；使用死活染料排除死细胞；样本制备成单细胞悬液后用滤膜过滤组织团块 |
染色时间太长 | 抗体染色条件可参考说明书，并根据实验情况适当调整 |
洗涤不充分 | 优化洗涤步骤，适当增加洗涤次数 |
过度固定 | 尽量选择新鲜样本检测，可通过预实验确定适合样本的固定剂和固定条件 |
自发荧光 | 用空白对照确定自发荧光水平；基于“荧光素强度”、“相互干扰程度”等配色原则选择合适的流式抗体 |
封闭不充分 | 适当增加封闭剂的浓度或孵育时间 |
细胞群的设门不正确 | 确保对细胞群的正确设门，使用死活染料并对单细胞群设门，可大幅度减少假阳性 |
补偿不当 | 尽量选择发射光谱不重叠的染料；检查补偿设置，确保每种荧光染料的信号正确补偿 |
在实际操作中，实验结果可能受到多种因素的影响，如抗体选择、样本制备、实验操作、仪器设置等。我们给大家列出实验结果中常见的三种异常情况和相应的解决方案，包括无信号或信号弱、荧光强度过高、背景高，希望能帮助大家得到满意的实验结果。更多流式实验干货，请持续关注流式课堂专栏！
