流式课堂 | 流式实验这些注意事项你get了吗

流式细胞术（Flow Cytometry）是一项集合了细胞生物学、免疫学、流体力学等多个学科在内的生物学技术，普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学等研究领域。

在完整的流式实验中，需严谨认真地操作以得到准确的实验结果。本期，我们将从样本处理、实验设计、抗体染色、仪器检测四个主要方面探讨流式实验的注意事项。

1. 样本处理

在流式检测实验中通常需要收集足够数量的、具有完整活性的细胞作为样本进行检测，对于不同类型的样本，可以选择适当的方式将其处理成适合实验的单细胞悬液。

(1)  单细胞悬液的制备

外周血样本：通常在采血后使用肝素做抗凝处理，并分离去除红细胞。对于需要进行后续进一步刺激培养的细胞，建议使用Ficoll法进行分离。

实体组织样本：一般选择机械研磨或酶解法处理成单细胞悬液。

(2)  细胞样本的收集

冻存的细胞样本在冷冻和解冻时会产生相应的应激反应，最好在进行一段时间的培养或传代使其表型和生物学功能恢复后再进行检测；收集和清洗细胞样本时，注意控制离心机的离心力在300×g以内，且不要使用过高的升速和降速。

样本制备完成后，染色前，需要对细胞进行计数并调整细胞悬液密度，确保实验组间样本的一致性。

2. 实验设计

指标选择：在选择指标时，尽量选择表达量高的指标；选择位于细胞膜外的表面蛋白作为检测指标，可以简化实验操作流程。如果分选后的细胞需要进行后续培养，必须选择细胞表面指标进行标记。

荧光素选择：尽量选择荧光亮度高、发射波峰差距较大的荧光素，可以减少信号间的相互干扰。在搭配指标和荧光素时，需注意流式配色的主要原则

对照组设置：此外，设置合适的对照组也有利于得到更加准确的分析结果。常用的对照设置包括单染对照、同型对照、荧光减一（FMO）对照、生物学对照等。对照设置方法可参考往期流式课堂。

3. 抗体染色

抗体染色是使抗体识别其对应的指标蛋白，从而将流式抗体上的荧光素特异性标记到目标细胞上的过程。使用过程中，应尽量减少抗体的反复冻融。以下列举几种抗体染色过程可能出现的情况：

(1)  抗体用量过多或不足：抗体用量过多可能导致背景信号显著增强，抗体用量不足则会导致染色结果分群不明显。可利用抗体滴定实验将抗体用量调整到相对合适的区间进行染色。

(2)  需要固定/破膜时的染色：对于需要同时检测细胞表面和胞内抗原的实验，建议在固定/破膜之前进行细胞表面抗原的染色。如果将细胞固定后再进行表面抗原染色，则需要通过实验确定合适的抗体。

(3)  细胞染色：死细胞经常会产生额外的自发荧光或非特异性吸附大量荧光抗体，导致假阳性，建议使用合适的死活染料对死细胞进行染色并加以区分。对于活细胞的染色建议在4℃环境中，固定后的细胞可以在室温环境染色。

(4)  荧光猝灭：荧光素在强光照射下容易发生猝灭。因此抗体的保存和孵育过程需在避光条件下进行。

4. 仪器检测

上机前：

(1)  在样本上机前，需要对流式细胞仪进行清洗，以免仪器中有荧光染料残留。可使用200目左右的尼龙筛网对样本进行过滤，去除样本中的团块。

(2)  细胞染色完成后，需尽快上机检测，以免放置时间过久或保存不当导致荧光素亮度减弱或猝灭。

上机时：

(1) 根据阴性对照的信号来调节仪器各检测通道的电压，以保证所有样本信号可以完整显示。当次实验中电压需保持不变。

(2) 利用合适的参数（通常是FSC/SSC）设定信号收集阈值。这样可以有效提高信号收集效率，并减小数据文件的大小。

(3) 为得到能够进行统计学分析的数据，通常有效细胞的信号需要在15000-20000以上，对于多层次圈门中比例极小的细胞群，通常建议最少的目标细胞群在500以上。

(4) 使用手动进样且样本数量较多时，上样前建议对流式管或离心管中的样本进行震荡或移液器吸打重悬，以保证样本的均匀程度。

结束上机：

采集样本结束后，及时对仪器进行清洗，避免仪器管路中的荧光染料残留或细菌生长。

以上就是Elabscience精心总结的流式实验注意事项，预祝大家都能得到优秀的实验结果！如果有更多流式实验的经验和心得，欢迎与我们进行沟通交流。更多流式实验干货，请持续关注流式课堂专栏。