巨噬细胞研究热点及解决方案：组织驻留巨噬细胞高效检测宝典！

还在为组织驻留巨噬细胞的检测而困扰？不同组织、不同来源、不同功能亚群——如何精准区分与高效检测？今天小E给大家系统解析脾脏、骨髓、腹腔等组织中巨噬细胞的Marker选择、实验流程及关键注意事项，助你轻松搞定实验、获取可靠数据！ 

一、组织驻留巨噬细胞简介

组织驻留巨噬细胞并非全部来自血液中的单核细胞，根据其发育起源，可以分为两大类：一类在胚胎发育早期，由卵黄囊或胎儿肝脏中的前体细胞分化而来，在成年后，主要通过局部自我增殖来维持群体稳定，而不依赖于骨髓造血，如大脑中的小胶质细胞、肝脏组织中的Kupffer细胞、肺组织中的肺泡巨噬细胞、皮肤中的朗格汉斯细胞等；另一类由骨髓中的造血干细胞分化为单核细胞，进入血液循环，在炎症、感染或组织损伤后，被大量招募到病变区域，补充或替换原有的巨噬细胞群体，如感染后病变组织周围的浸润巨噬细胞。组织常驻巨噬细胞是一个混合群体，在稳态下以胚胎起源为主，在炎症、感染等动态变化中，骨髓来源的细胞会不断融入。检测不同组织中巨噬细胞的分类和比例，可以精确的反应组织器官的功能状态。不同组织中的巨噬细胞分类和功能如下表所示。

二、组织驻留巨噬细胞检测结果分析

（1）脾脏巨噬细胞检测结果

图1. Balb/c小鼠脾脏细胞，使用Mouse CD45（E-AB-F1136Q）、CD11b（E-AB-F1081J）、F4/80（E-AB-F0995E）、CD64（E-AB-F1186D）、FITC-Lineage（CD3(E-AB-F1013C）、CD19（E-AB-F0986C）、Ly6G（E-AB-F1108C）、CD49b（E-AB-F1116C）)流式抗体染色并分析结果。

I. 巨噬细胞：CD11b^midF4/80^hi巨噬细胞或CD11b^midCD64^hi巨噬细胞，多为活化的炎症型巨噬细胞，以“强效抗感染和免疫清除”为核心。

II. 巨噬细胞：CD11b^hiF4/80^mid/hi巨噬细胞或CD11b^hiCD64^mid巨噬细胞，多为急性感染期红髓区和白髓区活化的巨噬细胞，用于评估脾脏稳态应激状态与早期免疫异常。

III. 巨噬细胞：CD11b^lowF4/80^low巨噬细胞或CD11b^lowCD64^-/low巨噬细胞,多为定居于脾脏边缘区，白髓与红髓交界处的巨噬细胞（Marginal Zone Macrophage, MZM）以及静息态红髓定居巨噬细胞，是血液抗原进入脾脏的“第一道免疫屏障”。

（2）骨髓巨噬细胞检测结果

图2. Balb/c小鼠骨髓细胞使用Mouse CD45（E-AB-F1137T3）、CD11b（E-AB-F1081D）、F4/80（E-AB-F0995M1）、CD64（E-AB-F1186C）、APC-Lineage（CD3（E-AB-F1013E）、CD19（E-AB-F0986E）、Ly6G（E-AB-F1108E）、CD49b（E-AB-F1116E）)、DAPI（E-CK-A163）、MerTK系列抗体（火热上线中，详询）流式抗体染色并分析结果检测结果。

数据分析流程：圈出DAPI-的活细胞群，进一步圈出CD45+的白细胞群，再分析圈出lineage-(CD3/CD19/Ly6G/CD49b)细胞群（排除掉T细胞/B细胞/粒细胞/NK细胞），进一步圈出CD11b和F4/80双阳性细胞后分析CD64+和MerTK+细胞群，该细胞群为骨髓中的骨髓驻留型功能巨噬细胞，主要发挥造血支持和骨髓稳态的作用。

（3）腹水巨噬细胞检测结果

图3. C57腹腔炎症小鼠取腹水样本，使用Mouse CD11b（E-AB-F1081D）、F4/80（E-AB-F0995Q）、CD86（E-AB-F0994H）、CD206（E-AB-F1135E）染色并使用流式细胞仪检测分析巨噬细胞的功能分型。小鼠腹水巨噬细胞为CD11b^hi/midF4/80^hi/mid巨噬细胞，是炎性活化的巨噬细胞，进一步分析该细胞群中CD206和CD86的表达，不同的细胞比例和分群代表巨噬细胞的不同功能状态。

三、组织驻留巨噬细胞的检测流程和注意事项

（1）脾脏巨噬细胞检测方案

①脾脏单细胞悬液的制备：取新鲜的小鼠脾脏样本，研磨法或者使用1 mL注射器吹打等方法制备成单细胞悬液，300×g离心3-5 min，弃上清。加入2 mL的1×ACK Lysis Buffer（E-CK-A105）重悬细胞，轻轻吹打混匀，室温静置2 min裂解红细胞。（注：裂解时间不超过2 min，防止裂解过度；室温过高超过25℃时，为保持细胞状态，建议4℃裂解）；裂解完成后，立即加入12 mL PBS缓冲液或RPMI-1640基础培养基吹打混匀终止裂解，300×g离心3-5 min，弃上清。

②脾脏巨噬细胞的流式检测：使用Cell Staining Buffer重悬细胞，细胞计数，并调整细胞密度至1×10⁶/mL。取100 μL细胞悬液加入CD16/32封闭抗体，轻轻吹打混匀，4℃封闭孵育10-20 min。再分别加入流式待测抗体，轻轻吹打混匀，继续4℃避光孵育30 min。加入1-2 mL的Cell Staining Buffer重悬细胞，轻轻吹打后150-300×g离心3-5 min，弃上清。加入100-300 μL的Cell Staining Buffer重悬细胞，上机检测。

（2）骨髓巨噬细胞检测方案

①骨髓单细胞悬液的制备：对小鼠实施安乐死，用70%乙醇浸泡3-5 min。在超净工作台中，将小鼠置于10 cm培养皿中，用剪刀去除皮肤，露出小腿，剪掉靠近下肢根部的主要肌肉，露出髋关节。切开股骨底部附近，切断跟腱，移除股骨周围的主要肌肉。在膝关节处切割，去除胫骨周围的主要肌肉，去除腓骨。去掉股骨和胫骨的骨痂，转移到新的6 cm细胞培养皿中，用1 mL注射器吸取1640全培养基（1640基础+10%FBS+1%P/S+1%L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（100×）），插入骨髓腔，轻轻吹打出骨髓细胞，重复步骤至骨髓细胞完全吹出。用滤网将细胞过滤到15 mL的离心管中，150-300×g离心3-5 min，弃上清。加入1 mL 1×ACK Lysis Buffer（注：1×红细胞裂解液建议4℃预冷，用前取出，严格把控裂红时间，避免裂红过度导致细胞损失），轻轻吹打混匀，室温裂红静置30 s，立即加入10 mL PBS轻轻吹打混匀细胞，终止裂解。150-300×g离心3-5 min，弃上清，即为小鼠骨髓细胞。

②骨髓单细胞悬液的流式检测：使用Cell Staining Buffer重悬细胞计数，调整细胞密度至1×10⁶/mL。取100 μL细胞悬液，加入CD16/32封闭抗体，轻轻吹打混匀，4℃封闭孵育10-20 min。再加入流式待测抗体，轻轻吹打混匀，继续4℃避光孵育30 min。加入1-2 mL的Cell Staining Buffer重悬细胞，轻轻吹打后150-300×g离心3-5 min，弃上清。再加入100-300 μL的Cell Staining Buffer重悬细胞，上机检测。

（3）腹腔巨噬细胞的制备及检测方案

①腹腔注射预备工作：使用巯基乙酸盐培养基配成3%的巯基乙酸盐肉汤，煮沸溶解。在121℃, 15-20 min高压灭菌后分装4℃保存。注射前，取出1支1 mL的3％巯基乙酸盐肉汤，用电磁炉沸水煮6 min，静置恢复室温。

②腹腔注射：左手抓小鼠，右手持注射器，缓慢以45°角扎进小鼠后肢根部连线处任一侧1.5 cm处，进针时感受到局部皮肤凹陷消失和落空感，深度不超过1 cm。轻轻挑动针头，避免扎进肠子，慢慢注射肉汤，完成后将小鼠放回鼠笼。每隔24 h注射1次肉汤，诱导72 h即可开始取小鼠腹水。

③腹水提取和检测：准备15 mL PBS（1×），4℃冰箱预冷15 min，颈椎脱臼处死小鼠。将小鼠腹部朝上，四肢固定在泡沫塑料板上，并用75%的酒精喷洗消毒。用镊子和剪刀剥离小鼠腹部表皮，暴露出腹膜，注意避免腹膜破裂。用5 mL注射器吸取5 mL PBS（1×），然后用镊子轻轻夹起中间腹膜，扎入注射器，尽量避免扎到组织脏器，然后缓慢注入PBS。手指轻轻按摩小鼠腹部约1-2 min，使PBS在腹腔中充分混匀，再用2.5 mL注射器沿着小鼠腹部侧面扎入，避免扎到内脏导致内出血。缓缓的抽取腹腔中的PBS，将PBS收集到15 mL的离心管中。重复操作，直到将预冷的15 mL PBS冲洗完为止。

④细胞保存：将收集好的腹水用离心机300×g离心3-5 min，离心完后去上清，留下白色沉淀。加入1-2 mL的Cell Staining Buffer重悬，放入4℃保存（或细胞计数后加入流式抗体进行检测分析或进一步进行细胞培养）。注：若需要后续持续培养的细胞，建议巨噬细胞提取过程使用无菌PBS，并在超净工作台操作。

⑤细胞培养及流式检测：在无菌环境下提取的腹水巨噬细胞使用1640全培养基重悬，调整细胞密度至5×10⁵/mL，加入1 μg/mL的LPS诱导24 h。收集细胞，300×g离心3-5 min，离心后去上清。加入Cell Staining Buffer重悬白色沉淀，调整细胞密度至1×10⁶/mL。取100 μL细胞悬液，加入CD16/32封闭抗体，轻轻吹打混匀，4℃封闭孵育10-20 min。再加入流式待测抗体，轻轻吹打混匀，继续4℃避光孵育30 min。加入1-2 mL的Cell Staining Buffer重悬细胞，轻轻吹打后150-300×g离心3-5 min，弃上清。加入100-300 μL的Cell Staining Buffer重悬细胞，上机检测。

四、相关产品

我们致力于为大家呈现精彩的实验成果，包括形态学观察、细胞内代谢途径分析以及细胞免疫特征的检测。后续将进一步推出Raw264.7和THP-1巨噬细胞M1/M2定向极化秘籍和检测方案及巨噬细胞代谢研究攻略。敬请持续关注我们的推文，并欢迎大家与我们交流探讨！更多的流式配色需求和分析需求请联系我们的技术团队！

参考文献：

[1] Zhao J, Andreev I, Silva H M .Resident tissue macrophages: Key coordinators of tissue homeostasis beyond immunity[J].Science Immunology, 2024, 9(94).DOI:10.1126/sciimmunol.add1967.

[2] Fujiyama S, Nakahashi-Oda C, Abe F, et al.Identification and isolation of splenic tissue-resident macrophage sub-populations by flow cytometry[J].International immunology, 2019, 31(1):51-56.DOI:10.1093/intimm/dxy064.

[3] Lazarov T, Juarez-Carreo S, Cox N, et al.Publisher Correction: Physiology and diseases of tissue-resident macrophages[J].Nature, 2023, 619(7970):E51-E51.DOI:10.1038/s41586-023-06386-w.

[4] Kaur S , Raggatt L J , Batoon L ,et al.Role of bone marrow macrophages in controlling homeostasis and repair in bone and bone marrow niches[J].Seminars in Cell & Developmental Biology, 2016:12.DOI:10.1016/j.semcdb.2016.08.009.

[5] Gupta S , Sarangi P P .Inflammation driven metabolic regulation and adaptation in macrophages[J].Clinical immunology: The official journal of the Clinical Immunology Society, 2023:246.DOI:10.1016/j.clim.2022.109216. 

往期回顾：

• 巨噬细胞研究热点及解决方案：免疫界“变形金刚”全景拆解！
• 巨噬细胞分离&诱导指南：从取材到培养，详细步骤搞定全能“免疫玩家”！