流式课堂 | T细胞分选与培养：从单细胞分离到功能表征的全流程解决方案

在免疫学研究领域，T细胞的分选、活化以及体外刺激培养实验是深入了解免疫系统机制的关键环节。今天，Elabscience将带领大家一同走进这些实验，揭开它们神秘的面纱。

一、CD4+ T细胞分选：精准捕获目标细胞

CD4+T淋巴细胞作为适应性免疫应答的核心效应细胞，其纯度与活性直接影响下游实验结果。本方案采用基于生物素-链霉亲和素系统的磁性分选技术（MACS），结合Elabscience® EasySortTM Mouse CD4+T Cell Isolation Kit（MIM002N），实现小鼠脾脏来源CD4+ T细胞的高效富集。

标准化操作流程：​​

1. 组织解离与细胞悬液制备​​

在 70 μm 细胞筛网上研磨脾脏，用预冷的 PBS 冲洗细胞筛网，收集细胞悬液于15 mL离心管 ，调整细胞浓度至2×108 cells/ mL。

2. 免疫磁珠标记与分离​​

加入适量抗体混合物，让它们与目标细胞“对上暗号”，混匀后室温孵育，之后进行清洗离心，去除多余的抗体。将细胞和Beads Streptavidin混匀后再次室温孵育，通过磁分离技术，就成功获得纯度＞95%的CD4+ T细胞，细胞重悬后放置在培养箱。

操作注意事项：

1. 每只小鼠可获得约 2-4×108个脾脏细胞，试剂盒1 Assay可分离1 × 107个细胞。

2. 细胞悬液和磁珠要直接加入无菌流式管底部，防止粘在壁上影响反应充分性和分选效率。

3. 用于分选的单细胞悬液需通过细胞筛网过滤掉细胞团块和组织，防止细胞成团干扰分选纯度。

4. 5 mL流式管适用分选细胞数不超过 2×108个，分选缓冲液体积建议控制在5 mL以内以保证磁珠分散度。

图1. 分选小鼠CD4+ T细胞检测结果

二、CD4+ T细胞活化实验：激发细胞的“超能力”

通过构建TCR信号通路激活模型，评估T细胞增殖与活化状态：

实验参数配置：​​

1. 活化条件​​

将细胞接种于合适的细胞培养板中，加入CD3/ CD28磁珠（Elabscience®CD3/CD28活化试剂盒MIM001A），注意磁珠与T细胞的比例为1：1，轻轻吹打混匀，补充IL-2（PKSM041523）至终浓度8 ng/mL，于37°C的CO₂细胞培养箱中培养72 h。

2. 活化标志物检测
​​

图2. 流式检测CD69/CD25双阳性率

图3. CFSE法评估增殖动力学

常见问题解决方案：​​

1. 如果培养48 h发现培养基液体变黄，可以沿着培养板壁缓慢补加培养基，注意不要吹打细胞。

2. 当细胞激活效果不理想时，可适当增加磁珠用量；若细胞死亡较多，就要适当减少磁珠用量。

3. 为确保流式检测数据的准确性，样本上机前需通过磁性分离架彻底去除未结合的磁珠。激活成功后可在显微镜下观察到细胞明显体积增大。以及可通过流式上机的FCS-H/ SSC-H图看到部分细胞往右上角增多。

三、体外刺激后检测Th1/ Th2/ Th17：洞察细胞分化方向

分选后的CD4+ T细胞可以进行体外刺激实验，就像是给CD4+ T细胞一个“成长的指引”，看看它们在刺激剂和阻断剂的作用下会如何分化。

实验方案设计：​​

1. 刺激条件

使用Elabscience® 细胞因子激活联合蛋白阻断试剂盒（E-CK-A091）刺激4-6 h。

2. 表型鉴定策略​​

采用多色荧光标记方案：

*推荐使用Elabscience®Th细胞鉴定试剂盒，试剂盒内包含实验所需全部试剂：刺激阻断剂、固定破膜液、流式抗体。

注意事项：

当细胞因子检测信号较弱时，可考虑延长刺激剂作用时间至12 h，同时阻断剂时间保持不变。此外，在制备小鼠全血样本时，抗凝剂的选择很关键，推荐使用肝素钠抗凝剂，因为EDTA或类似能螯合钙离子的抗凝剂会影响细胞因子的分泌效果，进而干扰实验结果。

实验结果展示：

图4. 分选小鼠CD4+ T细胞，刺激阻断后检测结果（左：未刺激阻断，右：刺激阻断5 h）

这一系列紧密相连的实验，从CD4+ T细胞的分选，到激发细胞的活化功能，再到对其分化方向的探索，环环相扣，为我们深入了解T细胞的奥秘提供了有力的工具。希望今天的分享能让大家对这些实验有更清晰的认识，一起感受科研的魅力！
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