流式课堂 | 【精准分型】效应CD4+ T细胞分型检测：揭秘免疫应答的“指挥家”

想知道免疫系统如何精准调控炎症与防御？效应CD4+T细胞亚群的平衡是关键！Elabscience将通过多色流式细胞术，带您直击免疫反应的“微观战场”！

1. 背景介绍

效应CD4+T细胞是适应性免疫的核心指挥官，通过分化成不同亚群调控免疫应答方向：

Th1细胞：主要分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2，这些细胞因子能促进Th细胞的进一步增殖，进而发生细胞免疫的效应。Th1细胞可通过分泌的细胞因子增强细胞介导的抗感染免疫。

Th2细胞：主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10及IL-13等细胞因子，这些细胞因子能促进Th2细胞的增殖，进而辅助B细胞活化，从而促进B细胞的增殖、分化和抗体的生成，发挥体液免疫的作用。同时，这些细胞因子可抑制Th1细胞增殖。

Th17细胞：主要分泌IL-17（包括IL-17A到IL-17F）、IL-21、IL-22、IL-26、TNF-α等多种细胞因子参与固有免疫和某些炎症的发生，在免疫病理损伤，特别是自身免疫病的发生和发展中起重要作用。

Treg细胞：主要分泌IL-10、TGF-β，抑制免疫反应，维持免疫耐受，防止自身免疫。

Th1/Th2/Th17/Treg的平衡是免疫稳态的关键，其失衡与感染、肿瘤、自身免疫病等密切相关。

2. 实验方案

2.1 动物模型

准备一只活小鼠，根据小鼠体重，将一定剂量的LPS（5 mg/kg）溶液通过腹腔注射到小鼠体内，继续喂养三天，诱导其发生炎症反应。

2.2 样本制备

1) 将正常和模型小鼠颈椎脱臼处死后，取小鼠脾脏；

2) 制备单细胞悬液：在70 μm细胞筛网上研磨小鼠脾脏，以预冷的PBS冲洗细胞筛网，收集细胞悬液于15 mL离心管中，300 g离心5 min；

3) 每只小鼠脾脏加入2 mL现配的1×ACK Lysis Buffer，轻轻吹打混匀，室温裂解2 min；

注：自备10×ACK Lysis Buffer（E-CK-A105），使用超纯水稀释至1×，现配现用，注意10×ACK Lysis Buffer和超纯水在使用前需4℃预冷。

4) 裂解完成后，迅速加入12 mL PBS缓冲液终止裂解，300 g离心5 min；

5) 离心完成后弃上清，用1 mL培养基将脾脏细胞重悬，细胞悬液用70 μm细胞筛网过滤于2 mL EP管，稀释后计数，调整细胞密度为1×107 cells/mL。

2.3多色流式染色

2.3.1 Treg细胞检测实验方案

1) 取100 μL 细胞（约1×106个细胞）到1.5 mL离心管中，分别加入CD3、CD4、CD25抗体，4℃避光孵育30 min；

2) 孵育完成后加入1 mL PBS，轻轻吹打混匀，300×g 离心5 min，弃上清，加入100 μL PBS重悬细胞；

3) 加入1 mL 1×Fixation Working Solution，涡旋混匀，4℃避光孵育30 min，反应完后，600×g 离心5 min，弃上清；

4) 加入2 mL 1×Permeabilization Working Solution，涡旋混匀，600×g 离心5 min，弃上清；

5) 加入100 μL 1×Permeabilization Working Solution 重悬细胞；

6) 加入Foxp3抗体，混匀后室温避光孵育30 min；

7) 加入2 mL 1×Permeabilization Working Solution，600×g 离心5 min，弃上清，加100 μL PBS重悬细胞，上机检测。

2.3.2 Th1/Th2/Th17细胞检测方案

1) 用1640完全培养基将样本制备成单细胞悬液，并调整细胞密度为1-2×106/mL； 

注：细胞密度不可过高，最大密度不超过2×106/mL，细胞密度过高会影响细胞的激活效率。

2) 每1 mL细胞悬液中，加入2 μL的500×Cell Stimulation MIX，于 37°C、5% CO2培养箱中孵育细胞0.5-1 h；

3) 每1 mL 细胞悬液中，加入1 μL 1000× Protein Transport Inhibitor MIX，于 37°C、5%CO2培养箱中继续孵育5-6 h；

4) 收集细胞悬液，300×g 离心5 min，弃上清，收集细胞沉淀，每1×106个细胞用180 μL 1×PBS重悬细胞，加入60 μL Fixation buffer 充分混匀，于4°C 固定过夜或室温固定1 h；

5) 固定后细胞会沉降至EP管底部，小心吸弃上清，加入1-2 mL 1× Permeabilization Buffer 混匀，500×g离心5 min，弃上清；

6) 加入100 μL 1× Permeabilization Buffer 重悬细胞，分别加入CD3、CD4、IFN-γ、IL-4、IL-17A抗体，室温避光孵育60 min，每15-20min混匀一次；

7) 孵育完成后，加入1-2 mL Cell Staining Buffer或1×PBS 混匀，500×g离心5 min，弃上清；

8) 加入100-200 μL Cell Staining Buffer或1×PBS 重悬细胞，上机检测。

流式抗体信息：

3. 结果展示

 


 

图1. 使用正常小鼠（对照组）和LPS模型小鼠（造模组）进行Th1/Th2/Th17/Treg流式检

4. 常见问题与解决方案

5. 应用场景拓展

1) 自身免疫病研究

多发性硬化症（MS）：Th1/Th17浸润中枢神经，Treg缺失加剧病情。

类风湿关节炎（RA）：Th17升高与炎症正相关，Th1/Th2失衡提示疾病活动度。

2) 感染免疫评估

胞内病原体（如结核）：Th1主导的IFN-γ反应是保护性免疫标志。

真菌感染：Th17介导黏膜防御，缺陷易致慢性感染。

3) 肿瘤免疫治疗

免疫检查点抑制剂：Th1增强抗肿瘤效应，Th17可能促进免疫逃逸，Treg抑制微环境需靶向清除。

4) 环境毒理学

三氯乙烯（TCE）暴露：通过DNA甲基化扰乱Th1/Th2/Th17平衡，诱发自身免疫病。

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以上就是效应CD4+T细胞分型检测的实验方案及应用介绍，如有相关问题欢迎留言！更多T细胞干货，请持续关注【流式课堂】专栏~