高分文献秘籍-细胞毒性T细胞介导的细胞凋亡解决方案

树突状细胞（DC细胞）和T细胞相互作用在肿瘤治疗中发挥着关键的作用，有研究表明骨髓来源的DC细胞（BMDCs）诱导CD103+CD8+组织驻留记忆T细胞亚型的产生，可增强生殖道局部肿瘤控制。同时，半乳糖酸阻断进一步提高了BMDCs诱导抗原特异性CD8+ T细胞增殖的能力。全转录组基因表达分析表明，对BMDCs进行仿硅酸处理可诱导参与T细胞活化、细胞粘附和细胞间相互作用的基因差异表达。细胞聚类测定和单细胞嗜性测量表明，糖基化减少的BMDC与CD8+ T细胞形成了更高的嗜性相互作用。DC细胞完成抗原呈递后，在CD8+ T细胞的激活和靶细胞的杀伤过程中，如何发挥协作功能以及调控机能；活化CD8+T细胞的记忆功能分群的变化与其细胞内的乳酸化、棕榈酸化、以及等代谢进程的关系是当前的研究热点之一。这些研究几乎均需要评估CD8+ T细胞的杀伤功能，本期小E将给大家提供DC细胞活化的CD8+ T细胞及评估CD8+ T细胞杀伤功能检测的解决方案。

一、实验原理简介

DC细胞是已知的功能最强抗原呈递细胞（antigen presenting cell，APC），可摄取消化外源抗原并装载在MHC分子中将其呈递给CD4+和CD8+ T细胞以产生免疫反应。共培养DC细胞和CD8+ T细胞是模拟体内CD8+ T细胞激活的最佳方法，因此是CD8+ T细胞相关研究不可替代的模型制备方案。具体而言，表达抗原肽-MHC Ⅰ复合物的DC细胞和CD8+ T细胞共培养时，CD8+ T细胞通过其表面的T细胞受体（TCR）与DC细胞上的抗原肽-MHC Ⅰ复合物结合而被激活。活化的CD8+ T细胞（也称细胞毒性T细胞）可通过溶解介质（如穿孔素和颗粒酶）的释放实现对靶细胞的杀伤力，也可通过T细胞表面Fas配体（FasL/CD95L）与靶细胞Fas受体（CD95）结合，触发Caspase-8激活，直接启动靶细胞的凋亡程序（PMID: 34725504）

二、实验结果展示

1、DC细胞的体外培养和促成熟

（A）流式细胞术检测体外诱导C57小鼠骨髓细胞为成熟DC细胞的效果，DC细胞经过促成熟和成熟的诱导培养后，MHC II/CD80/CD40/CD86的表达明显升高。

2、CD8+ T细胞的分选和抗原提呈及激活培养

（B）使用小鼠CD8 T细胞阴性分选试剂盒（货号:MIM003N）从C57小鼠脾脏中分选CD8+T细胞，细胞纯度使用流式细胞术进行分析。（C）使用灭活的靶细胞（Raw264.7）抗原装载DC后和分选的CD8+T共培养72 h，检测CD8+T的增殖。

3、CD8+ T细胞杀伤靶细胞的凋亡检测

（D）增殖后的T细胞和靶细胞（Raw264.7）按照1:10的比例共培养24 h，流式细胞术检测靶细胞（Raw264.7）中Caspase 3酶活性的变化，和Control组（正常的靶细胞（Raw264.7））相比，共培养组（Test）Raw264.7细胞的Caspase 3酶激活比例增加至79.44%。

（E）ELISA检测细胞培养上清中细胞因子的表达，与Control组（正常的靶细胞（Raw264.7））相比，共培养组（Test）的细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α表达明显增加。

三、实验方案及操作流程

1、DC细胞的体外培养和促成熟

取小鼠骨髓细胞，使用分化培养基培养6天后，使用成熟培养基培养24 h，获得成熟的DC细胞，详细操作流程请参考”Mouse Bone Marrow-derived Dendritic Cells (BMDC) Induction and Identification Kit”（货号：XJM003）。

80℃水浴加热灭活处理Raw264.7细胞4 h，离心洗涤，使用1640全培养基重悬细胞并计数。（1640全培养基配制方法请参考XJM003说明书）

将灭活处理的Raw264.7细胞和成熟的BMDC按照1:1的比例共培养24 h，收集细胞，100×g低速离心3分钟，去上清，收集细胞沉淀，1640全培养基重悬并计数。

2、CD8+ T细胞的分选和抗原提呈及激活培养

取C57小鼠脾脏细胞，研磨处理，使用EasySort™ Mouse CD8+T Cell Isolation Kit进行细胞分选，检测分选后CD8+T细胞的纯度。

分选后的T细胞加入CFSE染色液标记，37℃染色5 min后终止染色并离心洗涤，使用1640全培养基重悬并计数。

将CFSE标记的T细胞和BMDC细胞按照10:1的比例混合均匀，置入6孔板培养72 h，同时设置单独的CFSE标记的T细胞为Control组（共培养期间每24 h补加二分之一体积的1640全培养基）。

镜下观察，T细胞出现大量的增殖和聚团，收集细胞，150×g离心3 min，使用新鲜的1640全培养基重悬细胞并计数，取少量细胞检测CFSE增殖效果。

3、CD8+ T细胞杀伤靶细胞的凋亡检测

24孔板接种靶细胞（Raw264.7细胞），将T细胞和靶细胞（Raw264.7细胞）按照2:1比例混匀，37℃二氧化碳培养箱中培养24 h后收集细胞沉淀（同时收集细胞上清-20℃冻存备用）并使用PBS洗涤，加入Caspase3流式底物和Elab Fluor^® Violet 450 Anti-Mouse CD8a抗体共染，流式上机分析CD8阴性细胞（Raw264.7细胞）群中Caspase 3的酶活情况。（详细的Caspase3检测流程请参考E-CK-A483说明书）

将冻存的细胞上清室温溶解，10000×g离心5 min，收集上清，ELISA检测细胞上清中 IFN-γ、IL-2、 TNF-α的分泌情况。（详细的检测流程请参考ELISA试剂盒E-HSEL-M0007、E-MSEL-M0036、E-HSEL-M0009的说明书流程）。

注：若有更多实验内容方面的细节需要了解，欢迎和我们技术团队沟通，点击联系技术支持！

本实验方案全程使用Elabscience^®相关产品，主要产品列于下表：

四、更多体外模型处理方案参考

细胞凋亡常用的诱导剂以及体外研究的凋亡模型推荐以下：

常用诱导剂和抑制剂

1、常用诱导剂：

星孢菌素（Staurosporine，广谱蛋白激酶抑制剂）

喜树碱（抗肿瘤药物，通过抑制拓扑异构酶活性，干扰 DNA 合成）

常用抑制剂：

Z-VAD-FMK（广谱的 Caspase 抑制剂）

2、细胞凋亡模型

星孢菌素刺激Jurkat /HL-60细胞凋亡模型：5-10 μM星孢菌素诱导3-6 h

喜树碱刺激Jurkat/HL-60/Molt-4细胞凋亡模型：5-10 μM喜树碱诱导3-6 h

顺铂刺激Hela 细胞凋亡模型：3-5 μM顺铂诱导16-24 h

细胞毒性CD8+T细胞杀伤模型：细胞毒性CD8T细胞和目标细胞共培养

更多的铁死亡研究试剂盒、铜死亡研究试剂盒、双硫死亡试剂盒、乳酸化和棕榈酸化研究试剂盒均已上线，若有需要，请随时联系！

参考文献：

[1] Munir S , Hillyer P , Le Nou?N C ,et al.Respiratory Syncytial Virus Interferon Antagonist NS1 Protein Suppresses and Skews the Human T Lymphocyte Response[J].PLoS Pathogens, 2011, 7(4):1-17.DOI:10.1371/journal.ppat.1001336.

[2] Wang C , Barnoud C , Kizil B ,et al.Dendritic Cells Direct Circadian Anti‐Tumor Immune Response[J].FASEB Journal, 2022, 36.DOI:10.1096/fasebj.2022.36.S1.R2866.

[3] Yang B , Kim S , Jung W J ,et al.CTCF controls three-dimensional enhancer network underlying the inflammatory response of bone marrow-derived dendritic cells[J].Nature Communications, 2023, 14(1).DOI:10.1038/s41467-023-36948-5.

[4] Huang Y , Zhou L , Zhang H ,et al.BMDCs induce the generation of the CD103+CD8+ tissue-resident memory T cell subtype, which amplifies local tumor control in the genital tract[J].Cellular Immunology, 2022, 374:104502-.DOI:10.1016/j.cellimm.2022.104502.

[5] Balneger N , Cornelissen L A M , Wassink M ,et al.Sialic acid blockade in dendritic cells enhances CD8+ Tcell responses by facilitating high-avidity interactions[J].Cellular and Molecular Life Sciences, 2022, 79(2):98-.DOI:10.1007/s00018-021-04027-x.

[6] Waldman A D , Fritz J M , Lenardo M J .A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice[J].Nature Reviews Immunology[2025-06-30].DOI:10.1038/s41577-020-0306-5.

[7] Longchao Liu, et al. Rejuvenation of tumour-specific T cells through bispecific antibodies targeting PD-L1 on dendritic cells‍. Nature Biomedical Engineering‍. 2021. Doi：10.1038/s41551-021-00800-2.