产品常见问题
为了提供更好的客户支持，解决客户关于流式抗体相关知识的疑问，我们整理并发布了关于流式抗体的最常见问题的解答（FAQs），并将持续更新。
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建议使用离心机的离心力不超过300g，离心升速不超过3，降速不超过1，避免细胞受到损伤。免疫分型检测细胞因子时会使用CD4 [SK3]和CD4 [RM4-5]。因为①PMA刺激导致CD4发生内吞，克隆号为SK3和RM4-5的CD4对内吞影响比较小。②检测细胞因子时样本需要固定，SK3和RM4-5的CD4结合域受固定剂影响较小。大多数做小鼠巨噬细胞分选会用F4/80、CD11b确定总巨噬细胞，然后用CD86测M1型，CD206测M2型，以上只作为一个参考。如果流式分选得到的细胞还需进行培养，建议不要使用CD206，因为CD206需要进行固定破膜操作，细胞会全部死亡。此外，M1和M2的标志物表达量不高，很难分选。建议老师加上CD45、CD11b和死活染料。一方面，肿瘤样本中细胞种类多且巨噬细胞比例较低，很难找到目标群。另一方面，死细胞容易摄取抗体和探针，导致明显的非特异性染色，而且死细胞自发荧光特别强，会导致背景荧光增强，使得我们无法观察到一些标记的弱阳性表达。所以建议老师通过死活染料排除死细胞干扰，然后圈CD45阳性找到目的细胞群，最后通过CD11b和F4/80确定巨噬细胞比例。主要用到的化学试剂有0.1M PBS, EDTA二钠，NEM , 另有还原剂DTT或2-MEA，或TCEP ，还需要10kD超滤管或者脱盐柱。
根据抗体的特征，假定抗体是常规杂交瘤单克隆抗体（例如mouse IgG 2a ,150kDa），抗体在中性缓冲液（例如PBS+ EDTA,PH7.2）中，使用合适的量的DTT或者2-MEA 使其还原，暴露出-SH(巯基)，再将SMCC活化的染料加入到还原后的抗体（按照一定比例）中， 37℃或者4℃过夜混合反应，后添加化学试剂盒例如NEM（N-Ethylmaleimide） 封闭反应 0.5 h左右,即完成标记；后续可根据实际情况确定是否进行进一步纯化操作。
另外也可以使用SATA，或者2-亚氨基硫烷盐酸盐处理抗体，后续再加入相关试剂（SATA需要盐酸羟胺等）激活出-SH(巯基), 再将SMCC活化的染料加入到活化的抗体（按照一定比例）中， 37℃或者4℃过夜混合反应，后添加化学试剂盒例如NEM（N-Ethylmaleimide） 封闭反应也是可以，这种方式不会将抗体还原，但是可能会干扰抗原抗体结合位点，步骤也比较繁琐一些。
具体选择哪种方式需要根据抗体的类别和特性来定。荧光染料的使用比例也需要设定预实验去摸索。该裂解液不建议用于禽类。禽类的红细胞和人或小鼠有较大差异。可以，室温（20℃至25℃）裂解。建议客户使用胞内因子固定破膜剂，货号为E-CK-A109。CD16/32是特异性封闭剂，效果更好。Fc受体是细胞表面的CD16和D32蛋白，还有CD64，但是CD64是与FcR是强结合性的，不用特异性的抗体也能很好的结合。不行，建议使用超纯水、双蒸水、三蒸水或去离子水稀释。细胞染色缓冲液稀释破膜剂后会改变样本本身的渗透压以及盐粒子浓度，最终导致细胞状态变差甚至死亡。
我们没有验证过这款裂解液对其他细胞活力的影响。目前在外周血中，我们主要研究的研究对象还是白细胞。这款裂解液在正常情况下对白细胞影响不大。在《流式课堂|流式实验该准备多少管样本?如何设置对照? 》这篇文章中，我们建议使用FMO联合同型对照作为阴性对照去圈门，但FMO联合同型对照比较复杂，所以许多实验者会选择一种简单的方法——只使用同型对照作为阴性对照去圈门。同型对照用于消除抗体的非特异性结合而导致的背景染色，以帮助找到真正的阴性细胞群。
