产品常见问题
为了提供更好的客户支持，解决客户关于流式抗体相关知识的疑问，我们整理并发布了关于流式抗体的最常见问题的解答（FAQs），并将持续更新。
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同时检测多个样品时，只需要设置一个同型对照。但如果进行多个实验，每次都需要设置同型对照。表达量低或分群不太明显的指标建议做FMO联合同型对照（FMO-ISO），只需要做一管。以IFN-γ为例，以“预期IFN-γ表达较多的组的样本”作为FMO-ISO的样本，加入除IFN-γ外的其他流式抗体和IFN-γ的同型对照抗体，这一管样本称为FMO联合同型对照管。其余实验步骤与实验组一致，如死活、固定破膜等。封闭剂是液体，不需要加入溶剂溶解。μg包装的抗体需要做预实验对抗体进行滴定。我们没有做相应的滴定摸索，需要根据说明书的推荐用量、已知的抗体浓度以及自己细胞样本情况做抗体滴定实验去摸索最优的抗体使用量，所以无法给出具体的使用次数。
一般来说，一次实验每种抗体的使用次数是单染管一次，各个全染管分别加一次（有生物学对照和实验组），也就是说，一次实验每种抗体至少需要加3次。死细胞的自发荧光会很强烈，如果不用死活染料排除死细胞，可能会在分析结果的散点图中出现沿着对角线分布的细胞群，影响实验结果。所以为了确保实验结果的准确性，对于除脾脏外的组织样本，一般建议加死活染料来排除死细胞。如果是血液样本，如果样本新鲜，并且只做少数几个细胞表面染色的多染，也可以不排除死细胞，但这需要预实验确定样品中死细胞不多或者不会对结果造成干扰。
可通过对现有数据的死细胞群体进行分析，看看这些细胞在荧光通道的分布以及对应的比例是不是和活细胞群体基本一致，如果一致，可以不做死活细胞染色，不一致的话，建议加上活死染料。准备两管细胞流式上机，分别是对照组细胞和处理组细胞的空白管。上机时把所有荧光通道打开，看哪个通道有阳性信号，通过判断样本的干扰通道确定药物的荧光。建议直接将活体组织放在1%BSA的PBS、RPMI1640培养基或专用的组织保存液中浸泡，4℃可保存24h，最好尽快实验。建议老师提前做预实验验证一下。抗体用量主要是和液体体积和细胞数量有关。细胞量少的话可以将整个体系减半孵育，就是50ul 细胞悬液+2.5ul流式抗体。但是如果该样本目的细胞很少的话，细胞量也减少可能会对结果有影响，导致只能检测到很少的信号。红细胞裂解液不能去除血小板，血小板密度小，所以细胞离心后，血小板处于样本上清中，可通过弃上清去除血小板。
建议不要，因为钙镁离子会抑制酶活性。虽然目前市面上绝大部分的酶试剂中会添加EDTA来螯合钙镁离子，但还是建议您最好使用不含钙镁离子的HBSS。另外，如果后续的检测指标里有与钙离子相关的指标也建议使用不含钙镁离子的HBSS，如检测钙离子内流。如果后续的检测指标里有需要刺激活化的指标，还要注意使用的酶里不含EDTA，如活化的T细胞产生的IFNγ（因为EDTA会螯合钙离子，而钙离子是保证T细胞活化过程的重要微量元素）。①选择肝素抗凝管；②样本制备：a.人外周血样本：提前稀释红细胞裂解液，现配现用；b.PBMC样本：将样本及试剂复温到18~20℃以后再进行实验；实验环境温度控制在18~20℃；收集的新鲜人血尽量在1 h内进行PBMC分离; 加入血液时，避免冲散分层液面；加完后不要混匀或晃动管。③采血过程中，血样在肝素抗凝管中充分摇匀，避免血凝（肝素抗凝管保存时间一般不要超过12h）；④裂红时间不超过5min，建议做预实验摸索一下最佳时间；⑤无菌操作；⑥刺激和阻断时间建议通过预实验摸索。①所有样本管均需与实验组一样进行固定破膜，如blank对照，单标组，fmo-iso；②各组固定破膜时间尽量不要相差太久，如果样本量多，建议分批次操作；③对于肿瘤组织样本，由于检测目的细胞量少，需考虑增加抗体用量，上机时间数至少100万个；④建议增加75um微米孔径滤网进行二次过滤，提高免疫细胞纯度和含量；⑤由于刺激阻断时间较长，需要在刺激阻断时间结束前注意无菌操作。
参考资料：
①血样胞内因子实验注意事项的直播回放：https://www.elabscience.cn/resource-flow_cytometry-detail-965。
②肿瘤组织单细胞悬液的制备方案：https://www.elabscience.cn/resource-flow_cytometry-detail-261。
